分子信標(biāo)探針是核苷酸序列（DNA 和 RNA 的組成部分），用于熒光檢測特定 DNA 或 RNA 序列的存在。分子信標(biāo)（圖 1）的設(shè)計(jì)使得序列末端的少量核苷酸堿基（5 到 7 個(gè)）彼此互補(bǔ)并配對(duì)形成所謂的莖。莖的形成產(chǎn)生了***個(gè)未配對(duì)堿基的環(huán)，稱為莖環(huán)或發(fā)夾環(huán)。***后，在核苷酸序列的***端有***個(gè)共價(jià)連接的熒光團(tuán)，而在序列的另***端有***個(gè)熒光猝滅劑。當(dāng)分子信標(biāo)處于這種發(fā)夾形式時(shí)，猝滅劑通過 F?rster 共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET) 猝滅極大地減少了熒光團(tuán)的熒光。

圖1：分子信標(biāo)探針

與分子信標(biāo)具有互補(bǔ)堿基的核苷酸序列稱為互補(bǔ) DNA (cDNA)。在cDNA 存在的情況下，分子信標(biāo)發(fā)夾將打開并與 cDNA 雜交形成雙鏈序列（圖 2）。這種雜交導(dǎo)致猝滅劑和熒光團(tuán)進(jìn)***步分開，從而熒光團(tuán)發(fā)射不再被猝滅。通過監(jiān)測來自熒光團(tuán)的熒光變化，可以識(shí)別和量化 cDNA 的存在。

圖2：分子信標(biāo)和cDNA之間的反應(yīng)，其中a）是cDNA，b）分子信標(biāo)，c）雜交雙鏈序列。

分子信標(biāo)探針可以定制設(shè)計(jì)以靶向特定的 DNA 或 RNA 序列，從而允許分子信標(biāo)用于 DNA 和 RNA 的實(shí)時(shí)檢測和定量。主要用于PCR 定量、體內(nèi) RNA 檢測、病原體檢測、病毒載量定量和研究核酸-蛋白質(zhì)相互作用。分子信標(biāo)的使用，加上靈敏的熒光光譜儀和樣品溫度控制，有助于測量極低濃度的 DNA 或 RNA。

分子信標(biāo)探針及cDNA 購自于默克公司。所有數(shù)據(jù)均從配有 SC-27 （4位溫度控制樣品模塊） Edinburgh Instruments FS5 熒光分光光度計(jì)獲得。SC-27 用于在單獨(dú)攪拌的同時(shí)加熱四種具有不同濃度 cDNA 和分子信標(biāo)的溶液。配置100 nM 的分子信標(biāo)以及0 nM、20 nM、40 nM 和 60 nM cDNA 溶液。

cDNA和分子信標(biāo)之間的雜交可以在信標(biāo)處于閉合發(fā)夾形式時(shí)發(fā)生，但會(huì)緩慢進(jìn)行。可以通過加熱分子信標(biāo)以打開發(fā)夾結(jié)構(gòu)來加速雜交。當(dāng)加熱時(shí)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖堿基對(duì)之間的吸引力被克服，這被稱為變性，并且發(fā)夾打開。可以使用溫度依賴性熒光研究此開口的溫度依賴性（圖 4）。

將具有不同 cDNA 濃度的分子信標(biāo)的四種溶液移至比色皿中并放置在 SC-27 的四個(gè)位置。為了促進(jìn) cDNA 和信標(biāo)序列的雜交，將溶液通過在 60°C 加熱并在該溫度下保持 20 分鐘進(jìn)行溫育。然后冷卻回 20°C 并在該溫度下再保持 20 分鐘。這種加熱和冷卻的孵化過程增加了分子信標(biāo)和 cDNA 之間的雜交率，如圖 5 所示。

圖8：cDNA已知濃度樣品（橙色點(diǎn)）和未知cDNA濃度樣品（紅圈）的校準(zhǔn)曲線。

Edinburgh Instruments FS5 熒光分光光度計(jì)用于使用分子信標(biāo)探針以nM量***確定未知濃度的 DNA，與此同時(shí)，使用 SC-27 四位溫度控制樣品模塊孵育 DNA 和探針溶液，并自動(dòng)測量四種溶液的熒光強(qiáng)度，***后使用 FS5 Fluoracle ?軟件的定量分析功能分析測試結(jié)果。

(文章來源于互聯(lián)網(wǎng))